組織胞漿菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Histoplasm spp.

產品及特點

組織胞漿菌(Histoplasm spp)會引起組織胞漿菌病，是一種在世界范圍內廣 泛流行的傳染病，尤其是以嬰幼兒和老年人多見，男性發病率高于女性，臨床表 現有原發性肺部感染、播散性感染等，原發性肺部感染常表現為發熱、頭疼、全 身不適和干咳，嚴重者會出現低氧血癥和呼吸衰竭，播散性感染常有發熱、體重 下降、全身不適、肝脾腫大等癥狀，罕有伴發肺病變等癥狀，該細菌的感染對人 體健康造成嚴重損害，因此快速檢測組織胞漿菌通用具有重要意義。熒光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量 PCR 技術為 基礎開發的專門檢測組織胞漿菌通用的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據組織胞漿菌通用高度保守區設計,不擴增其他微生物。

3. 引物和擴增體系經過優化，靈敏性比常規 PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產生環境污染。

6. 本產品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

組織胞漿菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其 他試劑。 

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。

8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做樣品），6 個用于標準曲線樣 品。如果做定性檢測，則不需要設計標準曲線，只取 1×10E5 拷貝/μL 的 陽性對照做 PCR 陽性對照。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同 而自行優化）。

四、熒光定量 PCR 反應參數 

五、數據處理

12. 設定 60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。