戊型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis E Virus(HEV)

產品及特點

戊型肝炎(Hepatitis E )是一種經糞一口傳播的急性傳染病。HEV 是單股正鏈 RNA 病毒，呈球形、直徑 27~34nm 無囊膜，核衣殼呈二十面體立體對稱。戊型 肝炎病毒(HEV)為無包膜的球狀顆粒，分為 1~8 共 8 個基因型，中國內地流行株 主要為 1 型(曾稱緬甸株)，其次為 4 型。目前尚不能對 HEV 進行細胞培養，可實 驗室感染獼猴等多種猴類，HEV 對外界環境抵抗力不強。戊型肝炎傳播途徑(主要 經糞-口途徑傳播)和臨床表現(隱性感染及急性肝炎，不致慢性肝炎等)與甲型肝炎 相似。戊型肝炎在 15~39 歲的青年和成人高發。戊型肝炎亦為自限性疾病。HEV 對肝細胞亦無直接病變作用(CPE)。機體于病后可獲得一定的免疫力，但不夠穩固。 目前無戊型肝炎疫苗，預防戊型肝炎采用切斷糞-口傳播途徑為主的措施。本產品 是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發，專門檢測戊型肝炎病毒的試劑盒。它具有 下列特點：

1.一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
2.根據戊型肝炎病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應。
4.使用一管式qRT-PCR技術，RT和PCR兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

戊型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA段作為陽性對照。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣 品做陽性對照，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照 梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。

7. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三、設置 RT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

8. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照，6 個用于 RT-PCR 陽性對照。 9. 在標記管中按下表加入各成分： 

9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。

四、數據處理 10. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。