鏈球菌B組染料法熒光定量PCR試劑盒

Group B Streptococcus spp.(GBS)

產品及特點

鏈球菌B組(Group B Streptococcus spp, GBS)能引起牛乳房炎，嚴重危害畜牧業，因此早期被畜醫界重視。經過幾十年的研究，發現B族鏈球菌還可引起新生兒敗血癥、肺炎、腦膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生兒，還有可能有嚴重的神經系統后遺癥，包括腦積水、智力障礙、小頭畸形、耳聾等。同時，B族鏈球菌還可引起孕婦感染、引起早產、胎兒發育不良（低體重兒）、胎膜早破及晚期流產，因此快速檢測鏈球菌B組具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測鏈球菌B組的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供DNA模板。
2.特異性高，引物是根據人鏈球菌B組高度保守區設計,不會擴增其他細菌。
3.引物和擴增體系經過優化，靈敏性比常規PCR高100倍。
4.提供無傳染性的PCR陽性對照，便于區分假陰性樣品。
5.一管式操作，熒光PCR檢測，不容易產生環境污染。
6.本產品只能用于科研，本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR。

鏈球菌B組染料法熒光定量PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DN段作為陽性對照。
1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3.在7號管中加入5 μL 陽性對照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8.如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
9.如果進行定量分析，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，則6個標準曲線樣品只選一個做（可以選4號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應設置。
10在標記管中按下表加入各成分：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）。

四、熒光定量PCR反應參數
五、數據處理
12.設定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。
13.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
14.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性