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貼壁細胞和懸浮細胞免疫熒光染色方法

閱讀:2153      發布時間:2021-6-7
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  【步驟】(以間接免疫熒光法為例)
 
  1  細胞準備與固定
 
  (1)單層生長細胞:取對數生長細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成單細胞懸液。將細胞接種到預先放置幾張6×22mm蓋玻片的培養瓶或培養皿中,置二氧化碳培養箱培養1-3天,待細胞接近長成單層,取出蓋玻片,進入PBS(0.01 mol/L,pH7.4)洗2次,然后根據實驗目的,選擇適當固定劑固定細胞。常用固定劑有:95%乙醇(固定時間10-30min),丙酮(5-10min)等。
 
  (2) 懸浮生長細胞:取對數生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,或用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片,把細胞片浸入95%乙醇或丙酮中固定。
 
  2  將已經固定的細胞玻片放入蓋片染色缸,用PBS振洗5min,取出吹干。
 
  3  滴加適當稀釋的特異性抗體,置于濕盒內,37度保溫30-60min或度冰箱過夜。
 
  4  PBS振洗3次,每次5min,吹干。
 
  5  滴加適當稀釋的熒光素標記抗體,置于濕盒內,37度保溫30-60min。
 
  6  PBS振洗2次,每次5min,然后用蒸餾水振洗1次。
 
  7  50%緩沖甘油封片。
 
  【結果】
 
  在熒光顯微鏡下觀察,陽性部位出現熒光,依熒光素種類不同呈現不同顏色的熒光,入FITC呈現黃綠色熒光,羅丹明B200呈現橙紅色熒光。
 
  標本染色反應后應及時觀察并照相。若無時間立即觀察標本,可把標本放入4度冰箱保存。但應注意,過夜后特異性熒光減弱30%,一周后則減弱50%。如果用聚乙烯醇封片,可保存較長時間。

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