狗外周血單核細胞分離液試劑盒

本品用于分離狗外周血單核細胞。

本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

狗外周血單核細胞分離液試劑盒

操作步驟： 1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。 2. 取一支無菌離心管，先加入試劑A，再加入試劑D，使兩者形成梯度界面（試劑A：試劑D的體積比為3：2，如稀釋后的血液樣本小于5ml，則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D；如稀釋后的血液樣本大于5ml，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等），兩種試劑的分層一定要清晰。 3. 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因為兩者的密度差異，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多，加樣的時間較長，在離心之前出現紅細胞成團下沉屬正常現象） 4. 室溫，水平轉子500~800g，離心20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時間越長，分離條件需自行摸索，離心轉速不超過1000g）。 5. 離心后將出現明顯的分層： 層為血漿層；第二層為白色單核細胞層；第三層為透明試劑D液層；第四層為半透明試劑A液層；第五層為紅細胞層（如圖示）。 6. 小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細胞層到另一無菌的15ml離心管中，加入10mL細胞洗滌液或PBS，顛倒混勻，250g，離心10min。 7. 棄上清，5mL的細胞清洗液或PBS重懸細胞，250g，離心10min。 8. 重復步驟7 9. 棄上清，細胞重懸備用。 10. 差異貼壁法純化細胞：用單核細胞培養基以10 6個/ml的密度重懸細胞，將細胞鋪于細胞板或細胞瓶中，置于細胞培養箱中進行貼壁培養。 1) 2~4 h內貼壁的為單核細胞。 2) 10~24 h內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞 。 3) 不貼壁的為淋巴細胞。根據不同細胞的貼壁時間存在差異，以達到簡單純化單核細胞的目的。此法成本低，操作簡便。如需獲得高純度的目的細胞則需選用免疫磁珠分選或者是應用流式技術分選細胞。