目錄:上海乾思生物科技有限公司>>細胞>>細胞系>> BY-1358CHO/Dnmt3b-7中國倉鼠卵巢細胞系
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來源與構建：該細胞系以 CHO-K1 為親本，通過設計靶向 Dnmt3b 基因第 7 外顯子的 sgRNA，經慢病毒介導的 CRISPR/Cas9 系統實現基因編輯，篩選獲得 Dnmt3b 表達下調 70%-80% 的單克隆株（“Dnmt3b-7" 標識靶向位點與克隆編號）。構建過程中未引入外源抗性基因，通過 T7EI 酶切與測序驗證，確保編輯效率＞90%，且無脫靶效應（全基因組測序顯示脫靶率＜0.01%）。
形態與增殖：體外培養呈上皮樣形態，貼壁生長時細胞鋪展面積略大于野生型 CHO，排列較疏松；懸浮培養形成直徑 25-50μm 的聚集體，均一度良好（變異系數＜18%）。37℃、5% CO?條件下，增殖周期約 32-38 小時，較野生型延長 4-6 小時，適應含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基與無血清培養基，傳代 80 次以上 Dnmt3b 表達量穩定（下調幅度波動＜5%），凍存復蘇后存活率超 85%。
功能特征：核心優勢在于 DNA 甲基化譜的特異性改變：全基因組甲基化芯片顯示，其基因組 CG 島甲基化水平平均降低 28%，其中啟動子區低甲基化基因占比達 15%（顯著高于野生型的 3%），尤以細胞周期調控、代謝相關基因啟動子低甲基化最為顯著（如 CDKN2A 啟動子甲基化水平下降 42%）。同時，Dnmt3b 下游靶基因（如 HOX 家族基因）表達量上調 2-5 倍（qPCR 驗證），wan美模擬 Dnmt3b 功能缺失的表觀遺傳表型。
表觀遺傳調控機制研究
基因表達調控分析
表觀遺傳藥物篩選
貼壁培養操作：
復蘇：從液氮取出凍存管，37℃水浴 1-2 分鐘解凍，轉移至含 10mL 預熱培養基（DMEM/F12+10% 胎牛血清）的離心管，1000rpm 離心 5 分鐘，重懸后接種至 T75 培養瓶，37℃、5% CO?培養箱靜置培養（無需添加篩選抗生素）。
換液：接種 24 小時后首ci換液，去除未貼壁細胞，此后每 48 小時換液一次，維持細胞密度 1×10?-5×10?個 /cm2（密度過高可能導致甲基化譜漂移）。
傳代：當細胞融合度達 70%-80% 時，棄培養基，PBS 清洗 2 次，加入 2mL 細胞解離液，37℃孵育 3-4 分鐘（較野生型略長），鏡檢細胞脫落后加入 8mL 培養基終止解離，按 1:3 比例傳代，避免過度密集影響甲基化穩定性。
甲基化檢測樣本制備：
基因組 DNA 提取：取 1×10?個細胞，用 Qiagen DNeasy 試劑盒提取 DNA，經 RNase A 處理確保純度（OD260/280=1.8-2.0）。
甲基化分析：采用重亞硫酸鹽測序（BSP）檢測特定基因甲基化水平，或通過 Infinium 甲基化芯片進行全基因組掃描，數據分析需以野生型 CHO 為對照。
凍存流程：取對數生長期細胞，1000rpm 離心 5 分鐘，用凍存液（70% wan全培養基 + 20% 胎牛血清 + 10% DMSO）重懸至 6×10?個 /mL，分裝至凍存管，程序降溫盒 - 80℃過夜，次日轉移至液氮保存，保存期可達 5 年以上，復蘇后需傳代 2 次再進行甲基化相關實驗（確保表觀遺傳狀態穩定）。
優勢：Dnmt3b 表達穩定下調，甲基化表型重復性高（批間差異＜6%）；無外源抗性基因干擾，適合長期表觀遺傳研究；全基因組甲基化譜特征明確，可作為甲基化異常模型的標準對照；對甲基化藥物響應靈敏，篩選效率較野生型提升 40%。
局限性：部分基因甲基化改變可能非 Dnmt3b 直接調控（需結合 ChIP 驗證）；長期傳代（＞80 次）可能出現甲基化補償性恢復（約 5%-8%）；增殖速率較慢，大規模實驗需提前規劃培養周期。
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