W256Walker癌肉瘤256瘤株細(xì)胞系
W256Walker癌肉瘤256瘤株細(xì)胞系源自 Wistar 大鼠自發(fā)性癌肉瘤，是同時(shí)保留上皮源性惡性增殖與間葉組織侵襲特性的雙相型腫瘤模型，在癌肉瘤轉(zhuǎn)化機(jī)制、跨胚層分化及放hua療抵抗研究中具有不可替代的價(jià)值，為解析這種罕見雙相惡性腫瘤的生物學(xué)行為提供了經(jīng)典工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的癌肉瘤雙相形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞同時(shí)存在上皮樣與梭形細(xì)胞兩種形態(tài)：上皮樣細(xì)胞呈多邊形，排列成巢狀，胞質(zhì)豐富，可見細(xì)胞間連接；梭形細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列成束狀，胞質(zhì)內(nèi)富含微絲，兩種細(xì)胞比例約 1:2。核質(zhì)比普遍較高，染色質(zhì)粗顆粒狀，核仁明顯（2-3 個(gè)），核分裂象活躍（每 10 個(gè)高倍視野 10-12 個(gè)），電鏡下可見上皮樣細(xì)胞含橋粒結(jié)構(gòu)，梭形細(xì)胞含肌動(dòng)蛋白微絲，符合癌肉瘤的雙相分化特征。免疫表型分析顯示，細(xì)胞同時(shí)表達(dá)上皮標(biāo)志物 CK8/18（陽(yáng)性率 80%）和間葉標(biāo)志物 vimentin（陽(yáng)性率 90%），這種雙表型特征是其區(qū)別于單純癌或肉瘤的核心標(biāo)志，Western blot 可同時(shí)檢測(cè)到兩種蛋白的特異性條帶。
體外培養(yǎng)體系中，W256 細(xì)胞展現(xiàn)出混合生長(zhǎng)特性與強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛能。最適培養(yǎng)條件為含 10% 馬血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基（馬血清可維持雙相表型），37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 60 小時(shí)，倍增時(shí)間約 45 小時(shí)，貼壁生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞與懸浮生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡。其顯著特點(diǎn)是肝轉(zhuǎn)移傾向性ji強(qiáng)，Transwell 實(shí)驗(yàn)中穿透肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的能力是單純癌細(xì)胞系的 2 倍，這種器官特異性轉(zhuǎn)移與高表達(dá)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 ICAM-1 相關(guān)，黏附率達(dá) 55%，較其他腫瘤細(xì)胞高 30%。軟瓊脂克隆形成率達(dá) 40%，克隆內(nèi)可見兩種細(xì)胞混雜分布，連續(xù)傳代 40 次后雙相特征穩(wěn)定，凍存復(fù)蘇存活率超 85%。
在動(dòng)物模型中，W256 細(xì)胞的成瘤與轉(zhuǎn)移模式j(luò)i具特點(diǎn)。接種 1×10?個(gè)細(xì)胞至 Wistar 大鼠肌肉，7 天形成實(shí)體瘤，14 天出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，21 天肝轉(zhuǎn)移率達(dá) 90%（肺轉(zhuǎn)移僅 30%），模擬人類癌肉瘤的肝轉(zhuǎn)移偏好。病理顯示腫瘤組織內(nèi)上皮樣細(xì)胞巢與梭形細(xì)胞束交錯(cuò)分布，免疫組化可見 CK 與 vimentin 陽(yáng)性區(qū)域相互穿插，肝轉(zhuǎn)移灶保留原發(fā)灶雙相特征。熒光追蹤證實(shí)，細(xì)胞通過(guò)門靜脈系統(tǒng)定植肝臟，分泌 MMP-13 降解肝竇基底膜，該酶活性是原發(fā)灶的 1.8 倍，抑制劑處理可使肝轉(zhuǎn)移率下降 65%。
發(fā)病機(jī)制研究揭示其du特的分子異常。基因測(cè)序顯示，細(xì)胞存在 p53 缺失與 K-ras 激活突變，同時(shí)伴隨上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）調(diào)控因子 Snail 高表達(dá)，使上皮細(xì)胞獲得間葉表型。Western blot 顯示，PI3K/Akt 與 MAPK 通路同時(shí)激活，磷酸化 Akt 與 ERK 水平分別是正常組織的 5 倍和 4 倍，雙通路抑制劑聯(lián)合處理可使增殖率下降 70%，顯著優(yōu)于單通路抑制。與單純癌或肉瘤相比，其表觀遺傳修飾異常更顯著，H3K27me3 水平低 30%，導(dǎo)致多能性基因 Oct4 異常表達(dá)，可能與雙相分化潛能相關(guān)。
轉(zhuǎn)移機(jī)制方面，W256 細(xì)胞的肝靶向轉(zhuǎn)移涉及多重調(diào)控。除 ICAM-1 介導(dǎo)的黏附外，細(xì)胞高表達(dá) CXCR4，可響應(yīng)肝組織高濃度 CXCL12 趨化因子，遷移能力是 CXCR4 陰性細(xì)胞的 2.5 倍，CXCR4 拮抗劑可使肝轉(zhuǎn)移灶減少 50%。代謝組學(xué)分析顯示，其依賴谷an酰胺分解供能，肝內(nèi)谷an酰胺豐富的微環(huán)境可促進(jìn)轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)，谷an酰胺酶抑制劑處理使肝轉(zhuǎn)移瘤體積縮小 40%。
在藥物篩選應(yīng)用中，該細(xì)胞系為癌肉瘤的聯(lián)合治療提供依據(jù)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞對(duì)蒽環(huán)類藥物與抗血管生成藥物聯(lián)用敏感，殺傷率達(dá) 80%（單藥分別為 45% 和 30%），這種協(xié)同效應(yīng)與減少腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，聯(lián)合方案可使大鼠原發(fā)瘤縮小 60%，肝轉(zhuǎn)移率從 90% 降至 35%，生存期延長(zhǎng) 50%。因其雙相特征，還可用于篩選同時(shí)針對(duì)癌與肉瘤成分的藥物，某新型雙靶點(diǎn)抑制劑對(duì)兩種細(xì)胞亞群的 IC50 均 < 1μM，展現(xiàn)治療潛力。
腫瘤微環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)，W256 細(xì)胞可重塑基質(zhì)形成 “轉(zhuǎn)移前龕"。與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可誘導(dǎo)其分泌膠原 Ⅰ，形成有利于轉(zhuǎn)移的纖維化微環(huán)境，這種交互作用依賴 TGF-β1，中和抗體處理可使肝纖維化程度下降 50%，同時(shí)抑制轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)。缺氧條件下，細(xì)胞分泌 VEGF-C 促進(jìn)淋巴管生成，使區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增加 40%，VEGF-C 抗體可阻斷這一過(guò)程。
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