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明膠酶譜法試劑盒檢測步驟說明

時間:2019/5/29閱讀:2143
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   明膠酶譜法試劑盒檢測步驟說明
 
  1.制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS-PAGE凝膠。將10×substrate G融化,并90ºC加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrate G并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。
 
  2.待測樣品1:1稀釋于2×SDS-PAGE non-reducing buffer(用完后可自行配制:4%SDS,100 mM Tris-Cl pH6.8,20%glycerol,0.02%bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染Marker即可。陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100µl全血與100µl 2×SDS-PAGE non-reducing buffer等體積混合,取5-15µl上樣。明膠酶譜試劑盒現貨供應啦!
 
  3.低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
 
  4.洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml1×Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2×30分鐘。中間換液。
 
  5.孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1×Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC孵育1~5小時。陽性對照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時即可顯示。如MMP活性低,應延長孵育時間為10小時或過夜。
 
  6.顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(操作步驟見SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72(MMP-2)、92(MMP-9)、130(proMMP-9)、225(proMMP-9)kDa位置出現透明條帶。
 
  7.條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色。MMP條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
 
  7.條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示,并盡量設置為黑色。明膠酶譜法試劑盒MMP條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

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