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ATCC細胞轉染步驟詳細介紹
閱讀：1617 發布時間：2015-8-28 ATCC細胞轉染的方法主要有三種，分別是磷酸鈣-DNA 共沉淀法、DEAE-葡聚糖轉染、脂質體介導 DNA 轉染法，今天師兄就先從磷酸鈣-DNA共沉淀法講起。
磷酸鈣-DNA共沉淀法
核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現時，可使 DNA 附在細胞表面，這回利于細胞吞入攝取核酸，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA，僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞 DNA 整合，在細胞中進行穩定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術可以用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。該方法往往被用于貼壁細胞的轉染，也是的方法。
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1. 試劑的配制
(1)2×HBS 1.63 g NaCl ； 1.19g Hepes； 0.023 g Na2 PO4 ·2H2 O； 加水至100 ml pH 7.1 過濾，4℃保存
(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌
(3)TE：0.1mmol/L EDTA，1mmol/L Tris-HCL PH 8.0
(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2 O至10mL過濾除菌4℃保存。
(5)G418選擇培養基：用含10%胎牛血清的DMEM培養液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L
注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的低濃度。
2. 操作步驟
(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
(2)受體ATCC細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培養，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉染試驗。
(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備
①將供體細胞DNA和PSV2-neo質粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。
②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混勻30秒。
③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。
(4)轉染受體細胞
①將處于對數生長期已占瓶底50～70% 的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養基，每瓶5ml（25ml培養瓶）。
②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養液的細胞瓶中搖勻。
③置37℃ 5% CO2 培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。
④更換新鮮培養基，繼續培養24小時，誘導轉染基因的表達。
⑤更換濃度 800mg/L的G418選擇培養液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。
⑥培養大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3～4天更換一次選擇培養基。
⑦ 2 周后，對照ATCC細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大后再進行化和擴大培養，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。
今天就到這里，下期我會講講 DEAE-葡聚糖轉染法。