由于
鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體快速、低成本、可操作性、靈敏度和選擇性等優點，免疫分析法被廣泛用于檢測食品和環境中的污染物。以大限度地提高檢測靈敏度已成為免疫測定方法的研究熱點。就免疫分析原理而言，提高檢測靈敏度主要有兩種方法。開發各種抗原與抗體相互作用的信號放大系統是一種常見且有效的提高靈敏度的策略，如熒光底物信號放大和化學修飾信號放大。另一種提高抗體對抗原的親和力。傳統抗體通過免疫動物產生的親和力提高受到免疫耐受的限制。由于其復雜的結構，這些抗體也不適合體外親和成熟。相比之下,便于基因操作的基因工程抗體非常適合高親和力的抗體在體外成熟基因工程和蛋白質工程的進步，如單鏈可變片段和單域抗體(sdAb)。sdAb又稱納米體(nanobody,Nb)，由于其納米尺度的大小、良好的水溶性和對惡劣環境的高耐受性，而因此具有很高的研究價值。sdAb通常來源于駱駝科的重鏈抗體和軟骨魚的免疫球蛋白新抗原受體的可變區域，分別命名為VHH和VNAR。從三種噬菌體顯示的sdAb文庫中可以篩選出特異性的sdAb，包括免疫文庫、天然文庫和半合成/合成文庫。免疫庫通常用于篩選高親和力的sdAbs，目前已有大量的sdAbs被開發用于食品和環境檢測分析。此外，sdAbs的單區域特性有利于基因修飾，不同工程化的sdAbs包括體外抗體成熟提高親和度的sdAbs、融合酶的sdAbs、帶肽標記的sdAbs。如體外親和成熟的sdAb,研究表明，定向修飾獲得突變體sdAbN-28-t102y，該突變體親和度比親本sdAbN-28高3.2倍，在90℃，熱處理5分鐘后性保持55%。
體外誘導鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體親和成熟的方法有很多，包括易錯PCR、DNA重組、鏈重組、UV或化學誘變等。但突變的隨機性使選擇費時費力，限制了這些方法在體外抗體親和成熟中的廣泛應用。將計算模擬與高通量篩選技術相結合，可以高效獲得親和力更高的配體結合蛋白。蛋白質三維結構的準確性是計算模擬蛋白質與配體相互作用的關鍵。獲得蛋白質的三維結構的方法有很多種，如x射線晶體學、核磁共振光譜和冷凍電鏡等。然而，由于成本高、實驗條件苛刻、過程耗時、勞動密集型，這些方法沒有得到廣泛應用。蛋白質同源建模是一種簡單有效的為結構未知的給定蛋白提供結構模型的方法。比對搜索工具(BLAST)用于搜索同源序列，然后通過服務器建模，如SWISS-MODEL、3D-Jury、I-TASSER和MODELLER瑞士模型。此外，SWISS-MODEL將定性模型能量分析(QMEAN)估計與質量估計(GMQE)評分相結合，提供了一種綜合的質量評估，有助于獲得更準確的模型。此外，利用同源建模和分子對接的組合策略可以預測蛋白功能，分析抗體和抗原的分子間相互作用，這將有助于提高重組抗體在體外成熟的親和力。
研究表明，鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體通過同源建模、分子對接和丙氨酸掃描來識別用于OTA的sdAbNb28中的4個關鍵氨基酸(Gly53、Met79、Ser102和Leu149)。這些氨基酸配對組成兩個two-site飽和突變庫，突變后的Nb-G53Q&S102D親和力高于1.36倍。結果表明，同源性建模和分子對接結合丙氨酸掃描和雙位點突變適用于生成提高sdAbs親和力。由于sdAbs具有納米尺寸、單疇、易于表達等優點，應用核磁共振、x射線晶體結構分析、低溫電子顯微鏡等技術可以有效地獲得sdAbs的準確結構，并準確分析sdAbs與靶分子的相互作用。相比之下，目前使用的同源建模和分子對接方法成本低、省時。因此，本研究為提高AOA-sdAb的結合親和力提供了有效策略。
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