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冰凍切片的免疫組化染色操作步驟
閱讀：344 發(fā)布時間：2012-12-27冰凍切片的免疫組化染色操作步驟
1. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內(nèi)切片（ 也可- 80℃保存），厚度為 5～6μm。
2. 載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風吹干。
3. 如不馬上染色，可密封后- 20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘。
5. PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘，（ 必要時應用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔）
6. 3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，20 分鐘，避光;
7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘;
8. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理，37℃，15 分鐘。
附：正常血清配制 （ 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制）：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl （10%拋灑量） 計算。
9.滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時（也可置于 4℃冰箱過夜） 。
10.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
11.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。
12.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
13.滴加三抗 （SAB 復合物） ，37℃，40 分鐘。
14.PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。
15.DAB 顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止） 。
附：DAB 的配制① 儲備液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
16.自來水（細水）充分沖洗。
17.蘇木素復染，室溫，30 秒，自來水沖洗。
18.自來水沖洗返藍，15 分鐘。
19.梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。
20.二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘
21.封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。