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上海源葉生物科技有限公司
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IL-17的檢測(cè)
2012-5-5 閱讀(408)
IL-17是新近被確認(rèn)的一種細(xì)胞因子，由T細(xì)胞，主要是CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，其靶細(xì)胞廣泛。可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-KB，誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、ID8、GM-CSF、和膜性細(xì)胞間粘附分子1（1CAM-1），促進(jìn)由亞適劑量PHA所誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。目前編碼IL-17及其受體的基因核苷酸序列已被部分測(cè)定。
（1）IL-17的誘導(dǎo)：取人PBMC或純化的CD4+T細(xì)胞，加入誘導(dǎo)劑（PMA 5ng／mL+ionomycin 3ug／mL，或ConA 63ug／mL，或抗CD28抗體+CD3抗體），37℃孵育48—72h。收集培養(yǎng)上清液檢測(cè)IL-17含量（ELISA法）或生物學(xué)活性。
（2）IL-17生物學(xué)活性檢測(cè)：通過誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞或腎癌上皮細(xì)胞株（TUMT或CHA）產(chǎn)生IL-6、IL-8或GM-CSF可以檢測(cè)IL-17的活性。
1）滑膜細(xì)胞的制備：外科切取關(guān)節(jié)滑膜，剪碎后用4ug／mL膠原酶消化，37~C孵育2～3h，單個(gè)細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，洗去未粘附細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，用胰蛋白酶消化傳代。一般采用3—8代的滑膜成纖維樣細(xì)胞作為檢測(cè)用靶細(xì)胞。
2）取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔依次加人104滑膜細(xì)胞或是TUMT細(xì)胞（或CHA細(xì)胞），不同稀釋度的IL-17待測(cè)樣品，總體積為200uL，置370（2 5％C02溫箱中孵育48h，收集上清，置-20℃保存以備檢測(cè)細(xì)胞因子活性。用ELISA法或生物學(xué)活性測(cè)定法檢測(cè)上清液中的II-6、IL-8或GM-CSF等細(xì)胞因子的含量或活性，以此推測(cè)IL-17的活性。
