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1	酶標包被板	12孔×8條	7	顯色劑A液	6mL
2	標準品	0.3mL×6管	8	顯色劑B液	6mL
3	20倍濃縮洗滌液	25mL	9	終止液	6mL
4	樣本稀釋液	6mL	10	說明書	1份
5	特殊稀釋液	6mL	11	封板膜	2張
6	酶標試劑	6mL	12	密封袋	1個

備注：標準品（1號→6號）濃度依次為：20、10、5、2.5、1.25、0.625 ng/mL.

【需要而未提供的試劑和器材】

1、37℃恒溫箱

【操作步驟】

1、準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30分鐘。

2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加標準品和待測樣本：取足夠數量的酶標包被板，固定于框架上，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

6、加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。

7、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

8、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。

10、終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應（顏色由藍色立轉黃色）。

11、測定：以空白孔調零，在終止后15分鐘內，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

12、計算：根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。

【樣本要求】

1、樣本不能含疊氮鈉（NaN₃），因為疊氮鈉（NaN₃）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

3、樣本應充分離心，不得有溶血及顆粒。

【注意事項】

1、實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

2、酶標包被板開封后如未用完，應立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

3、建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。

4、牢記樣本已經稀釋5倍，計算結果乘以5才是樣本實際濃度。

5、本試劑盒定量范圍為0.625-20ng/mL，超過此范圍，為標準曲線延伸計算所得，不做為準確定量結果，請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結果（0.625-20ng/mL范圍內），乘以總稀釋倍數即為樣本zui終濃度。

6、若顯色過淺，可適當延長底物溫育時間。

7、為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復使用封板膜。

8、試劑盒保質期內使用，不同批號的試劑不得混用。

9、底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

【操作程序總結】

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30分鐘

洗板4次，加入酶標試劑，37℃反應30分鐘

洗板4次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘

加入終止液

15分鐘之內讀OD值

計算

【檢測范圍】

【規格】

【貯藏】

【有效期】

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