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技術文章

恒遠十年資深技術與您分享“WB內參抗體選擇原則”

閱讀:2337          發布時間:2014-10-21

內參抗體種類很多,比如β-actinβ-tubunlinGAPDHLamin B等,那么針對自己的實驗,我們該如何選擇呢?下面恒遠技術簡單介紹下選擇內參抗體應遵循的原則:

.樣本種屬來源:

首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。

1、哺乳動物的組織或者細胞樣本,通常選擇β-actinβ-tubulinGAPDHLamin BHistone H3Na,K atpase等。

2、植物來源實驗樣本,則可以選擇plant actinRubisco等。

3、其他來源樣本研究較少,所以就應該參照文獻報導,選擇合適的蛋白作為內參。

.目的蛋白分子量:

選擇內參抗體時,應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,此時不適宜選擇β-actin作為內參,可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內參。

.目的蛋白表達部位:

就一般的蛋白檢測來說,β-actinβ-Tubulin抗體等就可以了,而針對于核蛋白的定量,特別是樣本蛋白就是核蛋白時,選擇恰當的核蛋白內參則更能體現內部參照的價值。常用的核內參抗體有Lamin ALamin BHistone H3,除此之外,其它常見的核蛋白內參還有PCNAK70K80等,在一些文獻報道中,Erk2TATA binding protein(TBP)以及c-Junc-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測,常用的內參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測,常用VDAC1COX IV作為內參抗體。

以上幾條原則只是針對通常情況,但是需要注意的問題是——內參的選擇需要考慮實際的試驗環境,比如某些細胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高,不適合做內參。比如在涉及細胞增殖相關試驗中,c-Jun由于自身表達變化就不適合做內參;而在凋亡實驗時,TBPLamin等也不適合作為內參。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻,在實驗過程中也應該注意如果內參表達出現異常,應考慮這方面因素。

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