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細胞壞死和凋亡是兩種截然不同的細胞學(xué)現(xiàn)象，二者發(fā)生的過程在形態(tài)學(xué)上有很大的區(qū)別。在細胞壞死時，細胞膜發(fā)生滲漏，細胞內(nèi)容物包括細胞器以及染色質(zhì)釋放到胞外。而在細胞凋亡過程，起始階段，染色質(zhì)固縮、分離并沿核膜分布，細胞質(zhì)亦發(fā)生固縮，但細胞膜依然完整未失去選擇透性；在凋亡后期，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片斷，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍，以后逐漸分離，形成凋亡小體。

本產(chǎn)品提供的染料可以分別對正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞的細胞核進行染色。其染色原理為：Dye Reagent 1只進入活細胞，正常的細胞核及處于凋亡早期的細胞核呈現(xiàn)綠色；Dye Reagent 2只能進入死細胞，將死細胞以及凋亡晚期的細胞核染成橙色。因此通過在熒光顯微鏡下觀察細胞顯色和形態(tài)的不同，可以同時將正常細胞、壞死細胞、凋亡早期細胞和凋亡晚期細胞區(qū)分開來。

二、試劑盒組份

組份	Cat: KGA501 （50 assays）	Cat: KGA502 （100 assays）	儲存條件
Dye Reagent 1	25μL	50μL	室溫避光
Dye Reagent 2	25μL	50μL	室溫避光

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

熒光顯微鏡（510nm激發(fā)波長）、載玻片、蓋玻片、1.5m L Microtube、微量移液器

四、注意事項

1. Dye Reagent 1、2及Mixed Dyes Reagent有毒，操作時請戴手套；

2. 根據(jù)需要檢測的實際樣品數(shù)在使用前將兩種染料混合，剩余混合染液注意避光保存留待下次使用；

3. 利用血球計數(shù)板進行該項操作時，不要用血計板配套的那種質(zhì)地較硬的蓋玻片，而用普通的蓋玻片反而更利于結(jié)果的觀察。

五、操作方法

1. 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細胞凋亡；

2. 用PBS洗滌細胞二次，并配成濃度為5×10⁵~6×10⁶cells/ml細胞懸液；

3. 將Dye Reagent 1和Dye Reagent 2等體積混合形成Mixed Dyes Reagent（見注意事項2）；

4. 吸取25μL的細胞懸液同1μL的Mixed Dyes Reagent輕輕混勻；

5. 吸取上述10μL的混合液置于一潔凈的載玻片，并用蓋玻片蓋上細胞（見注意事項3）；

6. 熒光顯微鏡510nm激發(fā)波長觀察，分別對下列四類細胞進行計數(shù)，注意細胞總量須超過200個。

正常細胞：細胞呈圓形，核質(zhì)體被均勻染成綠色，大小形狀較單一；

壞死細胞：細胞呈橢園形，核質(zhì)體被均勻染成橙黃色，大小形狀較單一；

凋亡早期細胞：核質(zhì)體呈綠色，細胞形狀不規(guī)則，如呈新月形，；

凋亡晚期細胞：核質(zhì)體呈橙色，染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂成點狀，大小不一，可見胞質(zhì)芽狀突起。

n 計算細胞凋亡率和壞死率

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