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酵母β－半乳糖苷酶的測定
點擊次數：2634 發布時間：2012-2-13
1) 粗提取物測定
1．在適當溫度下(通常30℃)，用適當培養液將5ml細胞培養物培養到濃度為1×107～2×107細胞/ml。如果自主復制質粒的雜合基因表達，可使用一種適當培養基對存在質粒的菌株進行篩選。
2．在冰上冷卻細胞，離心收集。注意：以下步驟保持細胞在冰上。
3．棄上清液，將細胞懸浮于250μl裂解緩沖液中，然后置－20℃凍結，以備的第二天測定。以下步驟均在1.5ml離心管中進行。
裂解緩沖液：
100 mmol/L Tris-HCl (pH8)
1 mmol/L 二硫蘇糖醇
20％ 甘油
4．若細胞凍結，可在冰上將其凍結。加玻珠恰好到液面下，再加12.5μl PMSF母液。
5．以高速振蕩混合6次，每次15秒，間歇時放在冰上。
6．加入250μl的裂解緩沖液，用1000μl移液器插到離心管底部抽打使其充分混勻。
7．離心15分鐘澄清提取物。如果活性成分存在于顆粒狀碎片中，則可用未澄清的上清液，而測定的混合物將在步驟8澄清。
8．測定：
a. 加10～100μl抽提物到0.9ml的Z緩沖液中，用裂解緩沖液定容至1ml。
Z緩沖液：
16.1 g Na2HPO4•7H2O
5.5 g NaH2PO4•H2O
0.75 g KCl</P< p>
0.246 g MgSO4•7H2O
2.7 ml β-巰基乙醇
用蒸餾水定容至1升
調pH至7.0，保存于4℃
b. 在28℃水浴中將混合物保溫5分鐘。
c. 加入0.2ml臨硝基苯-β-D半乳吡喃糖苷(ONPG)母液，開始反應，注意準確時間，在28℃下保溫至混合物產生淡黃色。
d. 加入0.5ml碳酸鈉母液終止反應，注意準確記錄反應終止的時間，在420nm波長下測定光密度。
9．采用Bradford(1976)染料結合測定法測定抽提物中的蛋白質濃度。
a. 用蒸餾水將Bradford試劑稀釋5倍。用Whatman540號濾紙過濾稀釋試劑。
b. 加10～20μl抽提物到1ml稀釋試劑中，并混合。在595nm波長下測定形成的藍色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成藍膜影響測定結果。
c. 將BSA溶解于裂解緩沖液中，選用幾個不同稀釋度(0.1～1mg/ml)制成標準曲線。
10． 根據下面公式計算抽提物的特異活性：
( OD420×1.7) /(0.0045×蛋白質×抽提物體積×時間)
2) 通透細胞測定法
1．按上述方法培養細胞，測定培養物的OD600，當培養物細胞密度達1×106～1×107細胞/ml，同方法1離心收集細胞。
2．棄上清液，將細胞懸浮于1ml Z緩沖液中。
3．加入3滴氯仿和2滴0.1％ SDS，高速振蕩10秒鐘。
4．28℃下預保溫樣品5分鐘，同方法1加入0.2ml ONPG開始反應。
5．當試管中的樣品變為淡黃色時，加入0.5ml碳酸鈉母液終止反應。注意在測定時所花時間，離心10分鐘，棄細胞碎片和沉淀物。
6．測定反應物OD420的光密度。
7．β-半乳糖苷酶的活性單位為：
OD420 /(培養物OD600的光密度×測定體積×時間)