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公司動態(tài)

用免疫親和反應(yīng)選擇gⅥ—cDKA噬菌體文庫

閱讀:817          發(fā)布時間:2010-7-26

[器材和試劑]
●PBST
●牛血清蛋白(BSA)(Sigma)
●抗血清及gⅥ—cDNA噬菌體文庫
●無菌15ml聚丙烯管(Falcon)
●立式旋轉(zhuǎn)機
●蛋白A—瓊脂糖凝膠珠(Amersham Biosciences)
●無菌0.1mol/L鹽酸甘氨酸,pH 2.2加0.1%(w/v)BSA
●無菌2mol/LTris堿(未調(diào)節(jié)pH)
●于板*0F,
●37℃培養(yǎng)箱
●LB
●LBAT平板
●無菌直徑為16mm或18mm的培養(yǎng)管
●37℃振蕩培養(yǎng)箱

[方法]
1.用10m1含1%(w/v)BSA的PBST稀釋2.5ul抗血清,并倒入15ml聚丙烯管中,再加入1011~1012TU的gⅥ—cDNA噬菌體文庫。
2.室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育該混合物1小時。
3.往混合物中加500ul 1/1(體積比)蛋白A—瓊脂糖凝膠珠漿[在PBST用5%(w/v)BSA預(yù)處理],在室溫下再孵育l小時。
4.離心(500g 5分鐘)收集蛋白A—瓊脂糖凝膠珠并且用10ml PBST沖洗蛋白A—瓊脂糖凝膠珠10次。
5.在1ml PBST溶液中打散蛋白A—瓊脂糖凝膠珠,將混合物轉(zhuǎn)移到微離心管中并旋轉(zhuǎn)(10000g 10秒),除去上清液。
6.0.5m1 0.1mol/L鹽酸甘氨酸,pH 2.2,并加入0.1%(w/v)BSA溶液中打散蛋白A—瓊脂糖凝膠珠。
7.室溫下孵育樣品10分鐘。
8.快速離心樣品(10000g 10秒)并將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中。
9.加30ul 2mol/LTrls中和該溶液,在冰浴中保存溶液。
10.噬菌體擴增,將抽提出來的一半噬菌體(256ul)加到平板Topl0F’細胞中。37℃溫育30分鐘。

 

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