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凝膠遷移實驗(EMSA)-實驗操作方法

閱讀:2345      發布時間:2016-12-7
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1.探針的標記:
(1) 如下設置探針標記的反應體系:
待標記探針 (1.75pmol/微升) 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升
T4 Polynucleotide Kinase (5-10U/微升) 1微升
總體積 10微升
按照上述反應體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻。
(2) 使用水浴或PCR儀,37℃反應10分鐘。
(3) 加入1微升探針標記終止液,混勻,終止探針標記反應。
(4) 再加入89微升TE,混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見,通常不必測定探針的標記效率。
(5) 標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。
2.探針的純化:
通常為實驗簡便起見,可以不必純化標記好的探針。在有些時候,純化后的探針會改善EMSA的電泳結果。如需純化,可以按照如 下步驟操作:
(1) 對于100微升標記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無水乙醇,混勻。
(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小時,或在-20℃沉淀過一夜。
(3) 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清,切不可觸及沉。
(4) 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀,但不宜過分干燥。
(5) 加入100微升TE,*溶解沉淀。標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存于-20℃。

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