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對面的新手看過來,教您如何用酶標記抗體法染色

時間:2018/6/7閱讀:1794
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很多實驗新手剛剛做酶聯(lián)免疫試驗,都會有很多不了解的方面,上海勁馬將是您身邊的實驗好幫手。今天,小編在這里要和大家分享下如何運用酶標記抗體法染色。
酶標記抗體法的實驗原理總體來說和熒光素標記抗體法的原理類似,分為直接法和間接法,其原理基本相同,但敏感性不同。
一、直接法
直接法是將酶(如HRP)標記在特異性抗體(*抗體)上,然后用酶標記抗體直接與相應(yīng)原特異性結(jié)合,形成抗原—抗體—HRP復(fù)合物,zui后用酶底物DAB-H202顯色。該法的優(yōu)點是簡單、步驟少,省時、特異性高、非特異性染色輕:缺點是敏感性差,因為一個抗原決定簇只結(jié)合一個HRP分子(假設(shè)一個抗體分子與一個HRP分子結(jié)合)。另外,一種標記抗體也只能檢測一種抗原。若要檢測多種抗原,就必須標記每一種特異抗體,這樣既麻煩又不經(jīng)濟。目前此法很少應(yīng)用,但在單克隆抗體制備過程中,為了更特異地篩選單抗,仍常用此法。
二、間接法
間接法也稱夾心法,是直接法的簡單改進,將酶示蹤物標記在二抗上,再與*抗體(已與相應(yīng)抗原反應(yīng)形成復(fù)合物的IgG)反應(yīng),然后進行顯色反應(yīng)。此法要求第二抗體與特異性抗體(一抗)應(yīng)是不同種屬的動物產(chǎn)生,如特異性抗體(一抗)是兔抗人IgG,酶標記抗體(二抗)則可以是羊抗兔抗體。
間接法與直接法比較有以下優(yōu)點:
1、應(yīng)用面較寬,僅標記一種二抗就可以檢測眾多相同的*抗體,例如眾多一抗為兔來源,只要標記一種抗兔二抗就可用于所有抗兔一抗的檢測,不需要對每種特異性抗體進行標記;
2、敏感性增加,*抗體的工作濃度在直接法的基礎(chǔ)上進一步稀釋;
3、可以商品化購置;
4、可以設(shè)計各種對照。

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