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QQ交談技術文章
HtPot40干式恒溫金屬浴在耐亞胺培南銅綠假單胞菌CARB-3基因發現中的應用
點擊次數：4179 發布時間：2011-2-25
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是臨床常見的條件致病菌，由于其固有和獲得性耐藥，使臨床治療成為一大難題。CARB基因編碼產生羧芐西林酶，為β-內酰胺酶Bush分類中的2c，在我國CARB基因、流行基因亞型的研究未見報道。我們研究分析了2005年1～12月臨床分離的34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌（IMPRPa），發現了我院IMPRPa攜帶CARB-3基因，現總結報告如下。
1 材料與方法
1.1 菌株來源與質控菌株 34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌來自于2005年1～12月我院住院病人的臨床分離標本（包括：痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等），質控菌株包括：銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922。
1.2 菌株鑒定及亞胺培南耐藥菌株篩選 試驗菌株經BD Phoenix100全自動微生物分析儀鑒定到種，采用該儀器配套藥敏試驗復合板篩選亞胺培南耐藥的Pa。
1.3 主要儀器設備與試劑 Eppendorf centrifuge 5417R 低溫離心機，HtPot40干式恒溫金屬浴（合肥艾本森），Bio-RAD電泳儀，Bio-RAD 凝膠成像系統， 瓊脂糖（OXOID），100bp DNA Ladder Marker（大連寶森），6×Loading buffer（北京天為時代）。
1.4 模板DNA提取 采用蛋白酶K消化法。
1.5 基因擴增 引物序列為：P1：5′-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3′，P2： 5′-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3′，擴增產物為588bp。熱循環參數為：93℃預變性3min，93℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，zui后一個72℃ 延伸5min，共循環35周期。純水為陰性對照。耐藥基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。
1.6 結果判斷 取10μl擴增產物與2μl 6×上樣緩沖液混勻，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在100V電壓電泳30min，出現588bp的條帶即為CARB基因陽性。用凝膠成像系統觀察并照相。
1.7 序列分析 PCR產物經純化后送上海生工生物工程公司進行DNA序列分析，測得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 中的BLASTn程序進行同源性和基因亞型分析。
2 結果
2.1 CARB基因PCR檢測結果 34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌共檢出11株CARB基因陽性株，檢出率為32.4%，PCR擴增結果見圖1。
2.2 序列分析結果 任意抽取5株CARB基因陽性的PCR擴增產物進行單向測序，測得序列與GenBank中注冊號為DQ309773的CARB-3基因*同源（Identities=100%）。因此我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。
圖1 部分Pa菌株CARB基因PCR產物電泳圖 （略）
3 討論
CARB基因zui早于1981年在Pa中發現［1］，近年又從不動桿菌、弧菌屬、奇異變形桿菌中檢出，已發現CARB1-9型9個亞型［2～4］。我院IMPRPa的CARB基因攜帶率為32.4%，提示醫務工作者應重視和加強Pa的防治和耐藥監測。對CARB基因陽性菌株進行DNA序列分析，經同源性比較，結果顯示：我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。IMPRPa中CARB基因檢出、CARB-3基因亞型發現為國內報道。
銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，正常情況下不感染人體任何組織，但當人體免疫力下降或嚴重創傷或醫療操作后，Pa幾乎可以感染人體的任何組織，臨床可表現為局部化膿性炎癥和全身性感染，常常危及患者生命。碳青霉烯類抗生素（如亞胺培南）因其*的抗菌優勢，被臨床廣泛用于Pa引起的重癥感染，導致臨床分離株對亞胺培南耐藥性增加。
Pa對亞胺培南耐藥的機制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和產酶等三種機制［5］。我們對IMPRPa的耐藥機制的相關研究正在進行中。
作者：顏英俊 糜祖煌 劉華 楊洋 張凱 楊明清 黃文方 中華醫學研究雜志
【參考文獻】
1 Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing β-lactamases（CARB-5）from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett，1989,50（1-2）:45.
2 Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-O139belongs to a family of cassette-encoded β-lactamases.Antimicrob Agents Chemother，2004,48（10）:4042.
3 Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5） gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob Agents Chemother，2000,44（4）:1070.
4 Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative activity of beta-lactam agents （carbapenem excepted）against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy，2004,50（1）:31.
5 Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45（7）:1964.
作者單位：1 610072 四川成都，四川省醫學科學院、四川省人民醫院檢驗科2 214026 江蘇無錫，無錫市克隆遺傳技術研究所