Human Colonic Organoid Kit Plus（Differentiation）

人結腸類器官培養基套裝（分化）Plus

1、 產品描述

模基生物人結腸類器官培養基套裝（分化）【Human Colonic Organoid Kit Plus (Differentiation) 】是一款用于人結腸類器官分化的培養基。在分化培養基的培養環境下，人結腸類器官中的結腸干細胞和祖細胞逐漸分化為不同類型的細胞，如吸收細胞、分泌細胞、杯狀細胞等。這個分化過程對于研究結腸的發育、生理功能以及相關疾病的發生機制具有重要價值。

2、 產品信息

3、 其他自備試劑和耗材

4、 人結腸類器官培養基（分化）使用說明

1、   收到類器官培養基后，將培養基置于4℃冰箱進行解凍；

2、   待培養基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據日常需求量進行分裝，推薦分裝成10ml/管；

3、   分裝后的培養基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養基放置室溫平衡后即可使用。

5、 人結腸類器官的分化培養

人結腸類器官分化培養前需要經過原代建立擴增培養或者傳代擴增培養至類器官大小為600μm以上，如下圖：

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關的機構和政府法規。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

a)     原代人結腸類器官的建立

1、   原代組織樣本應在離體5min內放入裝有預冷的活組織保存液（2-8℃）的樣本管中，樣本需要被活組織保存液覆蓋（如果樣品已經放在其他緩沖液或培養基中，請用預冷的活組織保存液替換整個溶液）。低溫（2~8℃）運輸轉移至實驗室。

2、   實驗前先將基質膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養基放置室溫平衡。與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養防粘附潤洗液潤洗后使用。

3、   在潔凈工作臺中，將樣本轉移至培養皿中，評估獲得的組織是否由上皮組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用刀或和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續下一步。

4、   將組織樣本轉移至裝有預冷含雙抗DPBS的培養皿中，腸腔面朝上，一只手使用夾住腸組織一端，另一只手使用片輕輕刮去腸腔表面粘液或殘留的糞便，接著將結腸組織置于新的含雙抗DPBS的培養皿中清洗2-3次。將清洗后的腸碎至約2mm*5mm大小，隨后轉移至50ml離心管中，劇烈震蕩30s(垂直上下震蕩20次一上一下算一次，約1s三次)棄上清，重復3次。

5、   消化：加入30mL的DPBS溶液中再加入300μL 0.5M EDTA，至EDTA終濃度為5mM。置4℃搖床上，80rpm，消化20~30min（視樣本量而定，可在消化20分鐘時吹打混勻后鏡下觀察消化情況，若觀察到完整的隱窩結構即可進行下一步操作）。

6、   清洗：消化完成后，靜置待腸段沉淀，棄上清。加入預冷DPBS，輕柔搖勻，靜置后棄上清，重復2次以去除EDTA。

7、   重懸：加入30mL預冷的含0.1%BSA的DPBS，渦旋10s，取上清100μm濾網過濾，收集穿過濾網的組織懸液，重復收集2次。

8、   收集：300g離心力4℃離心3min。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎培養基中，取懸液進行隱窩計數。

10、 300g離心力4℃離心3min，吸棄上清液，根據培養需求取適量細胞沉淀加入基質膠（>70%）并在冰上混勻（注意：混勻吹打的動作要輕柔，切忌產生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內），混勻后置于冰上。注：基質膠應保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。大約50個隱窩應接種在25μL基質膠中。不要過度稀釋基質膠（基質膠比例應>70%（基質膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質膠和細胞的混合懸液點入培養孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質膠中，盡快進行種板，因為基質膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養板放入37℃和5%CO?的培養箱中15-25分鐘，讓基質膠凝固。

13、 待基質膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養基，避免破壞已凝固結構。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注：不要將培養基直接添加到基質膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結構。

14、 將培養板置于37℃和5%CO?的恒溫培養箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養基，小心地從孔中吸出培養基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養基。

16、 密切監測類器官生長狀態。

b)      人結腸類器官的傳代培養

1、   待類器官培養到直徑為600μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行類器官的傳代（每代約1周）。以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：

2、   吸棄舊培養基，加入等體積上皮類器官基礎培養基，用細胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質膠和類器官混合物，轉移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養箱中消化3分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成300μm左右類器官團塊。

注：一下步驟重懸沉淀需要控制吹打力度及次數，是類器官團塊控制在大小300μm左右。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎培養基輕柔吹打混勻以終止消化反應，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎培養基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中。

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養，在細胞沉淀中加入基質膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內），混勻后置于冰上。注意：基質膠稀釋比例應在70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

7、   將基質膠和細胞的混合懸液點入培養孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。大約50個類器官團塊接種在25μL基質膠中。注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8、   將培養板放入37℃和5%CO?的培養箱中15-25分鐘，讓基質膠凝固。

9、   待基質膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養基，避免破壞已凝固結構。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養基直接添加到基質膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結構。

10、 將培養板置于37℃和5%CO?的恒溫培養箱中。

11、 每隔2~3天更換一次培養基，小心地從孔中吸出培養基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養基。

12、 密切監測類器官生長狀態，直到類器官需要進行下一步實驗。

V2.0版

更新時間：2025/6/12