二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶，既控制著CO2 的固定，同時(shí)又制約著碳素向Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。

測(cè)定原理：

在Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）與 1 分子的CO2 結(jié)合，產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶I 氧化速率，還原型輔酶I 氧化速率可反應(yīng)Rubisco 的活性。

二磷酸核酮糖羧化酶試劑盒   光合系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 10ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 10ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 1 ml 試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（注意：試劑二、三、四溶解后，按需分裝-20℃保存。）自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

粗酶液制備：

①總Rubisco 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體Rubisco 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃， 8000g 離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中Rubisco 酶活性。

建議測(cè)定總Rubisco 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 Rubisco，則按照步驟②提取粗酶液。

（注意：粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。）測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

(1) 工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三 1：1 混合，用多少配多少；

(2) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10uL 樣本、10uL 試劑四和 180uL 工作液，混勻，立即記錄 340nm處 20s 時(shí)吸光值A1 和 5min20s 時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr 此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒。 2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；W：樣本質(zhì)量，g。 b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度，建議選購本公司生產(chǎn)的BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒。 2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：25℃中 1 g 組織 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義：

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；

V 樣：加入樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；W：樣本質(zhì)量，g。

二磷酸核酮糖羧化酶試劑盒   光合系列